Early events i Lactococcus lactis som mål for aktivitet og syrningsforløb

Det var projektets overordnede mål at skabe ny basal viden om tidlige begivenheder, ”Early events” i starterkulturer og udvikle hurtigmetoder til bestemmelse af starterkulturers fysiologiske status og forudsigelse af syrningsaktivitet.

Af: Grith Mortensen 

Projektet har benyttet to forskellige strategier til at belyse ”Early events”; en fysiologisk strategi, som primært anvendte fluorescensteknikker, og en molekylærbiologisk strategi, som skulle belyse proteinog genekspression.

Det overordnede formål med de fluorescerende teknikker var at beskrive kulturernes fysiologiske tilstand på enkeltcelleniveau, og belyse hvorledes celler med forskellig fysiologisk tilstand bidrager til det samlede resultat, f.eks. syrningshastighed. Intracellulær pH (pHi) blev bestemt med Fluorescence Ratio Image Microscopy (FRIM) som et mål for den enkelte celles fysiologiske tilstand. Målinger med FRIM af intracellulær pH kan give et meget hurtigt resultat(<30 min) der beskriver, hvor stor en proportion af cellerne, der er hhv. levende og døde.

Det overordnede formål med den molekylærbiologiske strategi var at undersøge, om der er gener eller proteiner, som bliver udtrykt præferentielt når kulturen bliver eksponeret for et vækstmiljø, dvs. ved podning i mælk. Kan der evt. identificeres ét eller flere enzymer/proteiner, som er udtrykt tidligt under syrning af mælk, kan disse danne basis for en hurtigmetode til beskrivelse af kulturens fysiologiske tilstand og forudsigelse af syrningsforløb. Proteinekspressionen iL. lactis subsp. lactis CNRZ 157 blev undersøgt ved hjælp af todimensional gelelektroforese (2DPAGE), og allerede i den tidlige nølefase var antallet af nysyntetiserede proteiner omkring 230. En stor del af de identificerede proteiner var involveret i omdannelsen af glukose, i proteinsyntese, og i nukleinsyreomdannelse.

Analysen af den tidlige genekspression i L. lactis blev foretaget med det formål at bekræfte proteinekspressionsstudierne samt at opnå en endnu bredere viden om intracellulære begivenheder i kulturens tidligste faser. Ekspressionsstudiet blev udført ved anvendelse af microarray teknologi, og der blev produceret microarrays med oligonukleotid DNA-prober som repræsenterede 40 gener. Flere af generne involveret i purin- og pyrimidin-omdannelse blev opreguleret kraftigt, og på grundlag af disse resultater valgtes enzymet adenylosuccinate synthetase (ASS), kodet af genet purA, til afprøvning i et videre modelforsøg. Både gen- og proteinekspressionsniveauet var forhøjet i den tidlige vækstfase, og ASS er desuden et velundersøgt enzym med tilgængelige metoder til aktivitetsmålinger.